手把手教你做細(xì)胞轉(zhuǎn)染（含操作指南）
![](http://cache1.bioon.com/webeditor/uploadfile/201611/20161117113258644.jpeg")
導(dǎo)語(yǔ)
轉(zhuǎn)染方法太過(guò)五花八門(mén)，讓人眼花繚亂。那么為了平安度過(guò)這道坎兒，選擇一個(gè)適合的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法才是至關(guān)重要的。
轉(zhuǎn)染方法大比拼
眾所周知，細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)主要分為三大類：化學(xué)法、物理法及生物學(xué)法。但是沒(méi)有一種方法是放之四海而皆準(zhǔn)的，即沒(méi)有任何方法適用于所有細(xì)胞和所有實(shí)驗(yàn)。因而只有依據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)要求選擇理想的方法，才能獲得漂亮的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
![](http://cache1.bioon.com/webeditor/uploadfile/201611/20161117113259305.jpeg")
接下來(lái)，就對(duì)其中幾種經(jīng)典轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行一一介紹。
1、DEAE-右旋糖苷法
常言道：同性相斥，異性相吸。因而，當(dāng)帶正電的DEAE-右旋糖苷與核酸中帶負(fù)電的磷酸骨架相遇，妥妥的火花四射，而后會(huì)被細(xì)胞膜抱團(tuán)相擁并通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用迎客到家。該法可用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，操作相對(duì)簡(jiǎn)單、結(jié)果可重復(fù)，但是對(duì)細(xì)胞有一定的毒副作用，且轉(zhuǎn)染時(shí)需要血清。
![](http://cache1.bioon.com/webeditor/uploadfile/201611/20161117113259163.jpeg")
2、磷酸鈣法
通常穿了“隱身衣”核酸分子在“照妖鏡”磷酸鈣的作用下可形成“肉眼可見(jiàn)”的磷酸鈣-DNA共沉淀，可使共沉淀中濃縮DNA分子與細(xì)胞表面結(jié)合并通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。該法可用于瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。然而因其對(duì)pH、溫度和緩沖液鹽濃度的微小變化十分敏感，所得結(jié)果容易出現(xiàn)差異，且對(duì)許多類型的細(xì)胞培養(yǎng)物(尤其是原代細(xì)胞)具有細(xì)胞毒性，轉(zhuǎn)染效率較差。
![](http://cache1.bioon.com/webeditor/uploadfile/201611/20161117113259345.jpeg")
3、人工脂質(zhì)體法
帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物，進(jìn)而可被細(xì)胞內(nèi)吞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染/瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染。這種方法幾乎適用于所有細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率高、重復(fù)型好，但轉(zhuǎn)染時(shí)需要去除血清，轉(zhuǎn)染效果隨細(xì)胞類型變化大。
![](http://cache1.bioon.com/webeditor/uploadfile/201611/20161117113259682.jpeg")
4、電穿孔法
有時(shí)，細(xì)胞有些“油鹽不進(jìn)”，就是不開(kāi)放門(mén)戶給核酸放行，此時(shí)各位小伙伴可采用一些強(qiáng)硬手段—電穿孔法。此法利用高脈沖電壓破壞細(xì)胞膜電位，使得DNA 通過(guò)膜上形成的小孔導(dǎo)入穩(wěn)定/瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染，適用于所有類型的細(xì)胞，但細(xì)胞致死率高，DNA和細(xì)胞用量大，且需根據(jù)不同細(xì)胞類型優(yōu)化電穿孔實(shí)驗(yàn)條件。
其他物理基因輸送法還包括基因槍、直接顯微注射等方式。前者又稱為粒子轟擊，可將包裹著核酸的顯微重金屬顆粒告訴射入受體細(xì)胞內(nèi)，適用于瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染。該技術(shù)可需要昂貴的設(shè)備，且細(xì)胞死亡率較高。而后者則是通過(guò)精細(xì)的注射針將核酸送入胞漿中，一次只能輸送一個(gè)細(xì)胞中，適用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或輸送人工染色體。
![](http://cache1.bioon.com/webeditor/uploadfile/201611/20161117113259915.jpeg")
5、病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)法
一般，病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染也稱之為轉(zhuǎn)導(dǎo)，它為難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型提供了一種方法，可用于蛋白質(zhì)過(guò)表達(dá)或抑制，是臨床研究中常用的方法。它通過(guò)侵染宿主細(xì)胞將外源基因整合到染色體中，可用于難轉(zhuǎn)染細(xì)胞、原代細(xì)胞的穩(wěn)定性轉(zhuǎn)染。
![](http://cache1.bioon.com/webeditor/uploadfile/201611/20161117113259370.jpeg")
細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作指南：以脂質(zhì)體為例
1.轉(zhuǎn)染前
首先，準(zhǔn)備細(xì)胞、質(zhì)粒和實(shí)驗(yàn)所需試劑。細(xì)胞好取實(shí)驗(yàn)室里已經(jīng)驗(yàn)證的易轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，如COS-1/Hela/CHO-K1細(xì)胞，同時(shí)實(shí)驗(yàn)前要重新復(fù)蘇一株低傳代細(xì)胞來(lái)確保該細(xì)胞株未被其他細(xì)胞和微生物污染。
選擇表達(dá)質(zhì)粒載體如β-gal載體，GFP載體等時(shí)，要先確保該質(zhì)粒能在所選的細(xì)胞系中表達(dá)良好。同時(shí)質(zhì)粒純化時(shí)要注意純化過(guò)程中勿使雙鏈斷裂以及無(wú)核酸酶和內(nèi)毒素污染。
同時(shí)準(zhǔn)備新鮮的培養(yǎng)基，使用前用0.22um濾膜過(guò)濾培養(yǎng)基來(lái)確保培養(yǎng)基無(wú)污染。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中勿加抗生素，且需要不斷監(jiān)測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到50-80%時(shí)，可用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。
2.轉(zhuǎn)染中
首先，由于不同質(zhì)粒和脂質(zhì)體的佳搭配比例不同，轉(zhuǎn)染前應(yīng)該做預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)摸索一個(gè)佳配比。作預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)，按照質(zhì)粒：脂質(zhì)體=1：1、1：2、1：3、1：4的梯度來(lái)檢測(cè)佳轉(zhuǎn)染比例，如下表所示。
![](http://cache1.bioon.com/webeditor/uploadfile/201611/20161117113259662.jpeg")
同時(shí)也需要設(shè)立對(duì)照實(shí)驗(yàn)，如試劑對(duì)照：僅加入轉(zhuǎn)染試劑，可確定轉(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞毒性。DNA對(duì)照：僅加入DNA，確定制備DNA的質(zhì)量是否對(duì)細(xì)胞存在影響。空白對(duì)照：用空載體制備轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物（建議3：1的比例），確定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生理或功能的變化是源于目標(biāo)基因，還是源于轉(zhuǎn)染過(guò)程本身。
其次，在正式實(shí)驗(yàn)中，需要小心輕柔將lipo2000加到培養(yǎng)基中并輕輕混勻，避免暴力吹打，使得脂質(zhì)體失效。轉(zhuǎn)染時(shí)各種培養(yǎng)皿添加的質(zhì)粒和脂質(zhì)體參考量見(jiàn)下表：
![](http://cache1.bioon.com/webeditor/uploadfile/201611/20161117113259476.jpeg")
3.轉(zhuǎn)染后
首先，轉(zhuǎn)染24h后需要觀察轉(zhuǎn)染過(guò)程對(duì)細(xì)胞毒性情況，如果毒性較高，可能是由以下原因造成的：
*初期細(xì)胞接種濃度太低
*轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入量過(guò)高，因?yàn)椴煌?xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)染的敏感度不同
*轉(zhuǎn)染后6小時(shí)需更換培養(yǎng)基，一是lipo2000具有一定毒性，二是培養(yǎng)基需要更換成有血清培養(yǎng)基。
其次，轉(zhuǎn)染后需要對(duì)轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行檢測(cè)，比如觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光情況、qPCR驗(yàn)證或WB檢測(cè)敲減或者過(guò)表達(dá)蛋白。
*對(duì)于β-gal表達(dá)載體：可用β-gal染色試劑盒進(jìn)行細(xì)胞染色并觀察細(xì)胞。轉(zhuǎn)染效率高的細(xì)胞在染色孵育后3-4h即可觀察到，轉(zhuǎn)染效率低的細(xì)胞則需要更長(zhǎng)的孵育時(shí)間。
*對(duì)于GFP表達(dá)載體：熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。如果細(xì)胞能在顯微鏡下被觀察到，至少需要有104-105拷貝的GFP蛋白表達(dá)，表達(dá)太弱的細(xì)胞無(wú)法鏡檢。GFP表達(dá)情況也能使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)可加入PI進(jìn)行染色以監(jiān)測(cè)死細(xì)胞情況。
后，若是轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率不高，可以通過(guò)兩種方法增強(qiáng)轉(zhuǎn)染效率。
（1）復(fù)轉(zhuǎn)染，即轉(zhuǎn)染后12-24小時(shí)再次進(jìn)行轉(zhuǎn)染，前提是該細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)體的耐受性較好，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞死亡數(shù)較少。
附錄：轉(zhuǎn)染中可參考的數(shù)據(jù)
![](http://cache1.bioon.com/webeditor/uploadfile/201611/20161117113259582.jpeg")
![](http://cache1.bioon.com/webeditor/uploadfile/201611/20161117113259470.jpeg")
![](http://cache1.bioon.com/webeditor/uploadfile/201611/20161117113259346.jpeg")
